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低速離心機提取脂肪干細胞的培養及鑒定實驗

2016/4/11 14:42:04??????點擊:

一、實驗技術及原理

 運用細胞培養技術、流式細胞術(體外擴增后ACSs的表型會發生改變,主要體現在細胞表面蛋白和細胞因子表達的變化),差異離心術(可將基質血管細胞沉淀與懸浮的成熟脂肪細胞分離,沉淀中除ASCs,還包括血細胞、成纖維細胞和內皮細胞,基質血管細胞沉淀可以接種到孰料培養瓶中,基質細胞可貼壁,造血和其他雜質細胞不貼壁,在隨后的傳代過程中被出去,最終得到的ASCs可再很長時間內保持摸分化狀態)。取C57BL/6 WT小鼠2只,常規麻醉消毒,取腹股溝脂肪組織剪碎至糊狀,PBS液沖洗去麻藥及血液,0.075%II型膠原酶消化(37℃,30分鐘)以去除外基質,生理鹽水終止膠原酶的消化,離心(1 200 g,10分鐘),去上清液及未消化的脂肪,10%FBS的DMEM重懸細胞沉淀,0.16 mol/L氯化氨溶解剩余紅細胞,離心洗滌,過200目銅網,得到單個核細胞。鏡下計數,按104個細胞/ml種植在培養瓶中,37℃ 5%CO2孵箱培養,24小時后第一次換液,以后3天換液一次,80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化傳代。細胞鏡下作形態學觀察及取第三代細胞用流式細胞儀作細胞周期及細胞免疫表型(CD29/CD44)的鑒定。

 二、實驗用品
1. 材料:C57BL/6 WT小鼠。
2. 試劑:PBS液,0.075%II型膠原酶消化,10%FBS,低糖DMEM。
3. 儀器設備:超凈工作臺、恒溫培養箱、普通顯微鏡、倒置顯微鏡、低速離心機、離心管、解剖剪、眼科剪、鑷子(尖頭、平頭和有溝鑷)、小燒杯,200目銅網過濾器,低糖DMEM、血球計數板、橡皮瓶塞、酒精燈、換藥碗。


脂肪干細胞的培養,分離,共培養 :

 將吸脂來源的脂肪組織用D-Hanks 沖洗,去除殘留的血細胞和組織碎片,把脂肪組織放入離心管中,記錄原始體積。向組織中加入等體積的0.1%Ⅰ型膠原酶,放入37℃氣浴振蕩器中消化30 min。然后將消化好的組織靜置5 min,待其分層后,用吸管吸取位于懸液上層的脂肪細胞,將含有脂肪細胞的懸液以1000 r/min(167g),離心2 min 后棄掉下層懸液得到脂肪細胞。

 脂肪干細胞的分離和培養

 參照文獻,同上述脂肪細胞的分離一樣,將脂肪組織沖凈,稱重后消化。當消化完成后,棄掉上層未消化的脂肪組織,將下層的細胞懸液以1500 r/min(375g),離心10 min 后棄上清,得到離心管底部的脂肪干細胞團,將其重懸,密度調整到1×105mL-1,然后接種在培養面積為25 cm2 的細胞培養瓶中。
 當干細胞長滿培養瓶后按一傳二進行傳代,具體的傳代方法是:首先,用D-Hanks 沖洗一遍細胞,然后加入2 mL 的混合酶溶液(0.25%胰酶和0.02%EDTA)消化,當在顯微鏡下觀察到細胞發生明顯的變形,縮成球狀后,立即用含有10%胎牛血清的培養基中止消化,并用吸管輕輕吹打瓶底部,確保細胞完全脫落分離到懸液中,再把細胞懸液置于低速離心機上,以1000 r/min (167g),離心5 min。最后,將離心得到的細胞團重懸,調整密度為合適密度進行接種。

 脂肪干細胞和脂肪細胞的共培養

 將準備好的脂肪干細胞和脂肪細胞分別置于Transwell 的上室和下層中,脂肪干細胞與脂肪細胞的個數之比分別為1:5,1:1,2:1 和5:1(4 組分別命名為A、B、C 和D 組)進行共培養,其中每孔中脂肪細胞的數量均為1×105 個。以上每組均做平行實驗(n=3)。

 成脂誘導對照實驗

 將干細胞以1.5×105 每孔的密度接種在六孔板中,以正常培養基培養的樣本為成脂分化實驗陰性對照組,以成脂誘導培養基培養的樣本為陽性對照組。具體方法是:向基礎培養基(DMEM+10%胎牛血清)中加入1 μmol/L 的地塞米松、10 μmol/L 的胰島素、200 μmol/L 的吲哚美辛和0.5 mmol/L 的異丁基甲基黃嘌呤,配制成脂誘導培養基,每周換2 次液,直到進行成脂染色觀察為止,以上對照組均做平行實驗(n=3)。

 油紅 O 和臺盼藍復合染色

 用 0.5%油紅O,對成脂誘導后的各組樣本進行染色。具體操作方法是:先用D-hanks將樣本細胞沖洗充分,然后加入油紅稀釋染色10~15 min,(油紅O 稀釋液配制方法:0.5%飽和油紅O 原液按3:2(油紅O:蒸餾水)加入蒸餾水,然后過濾,待用),接下來用75%的乙醇溶液將樣本分化至間質清晰,然后蒸餾水沖,最后再用臺盼藍對脂質以外的細胞核部分進行復染,并于100 倍鏡下觀察拍照。以每組樣本隨機選取5~10 視野進行拍照觀察以考察共培養方法的成脂誘導分化效果。

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